植物原位接种介导的小麦高效农杆菌转化方法实验一植物原位接种介导的小麦高效农杆菌转化方法-免疫在线蚂蚁淘旗下平台-

当前位置：首页 > 新闻动态 >

热卖商品

MPbio/琼脂糖分子生物学等级/288.7/45074

MPbio/琼脂糖多用途，分子生物学等级/793.6/45081

MPbio/抗冠状病毒（SARS-CoV-2）spike S2（B），小鼠，单克隆抗体/285/55181

MPbio/睾酮双抗体RIA试剂盒/1135/44293

新闻详情

植物原位接种介导的小麦高效农杆菌转化方法实验一植物原位接种介导的小麦高效农杆菌转化方法

来自 : 发布时间：2026-03-21

试剂、试剂盒仪器、耗材实验步骤

缓释肥乙酰丁香酮

盆钵植物支撑器LB培养基通用型试管YEP固体培养基TSIM培养基

一、材料1.母体植株的生长(1)将母体植株种植于12,7F(直径为13cm)的盆钵中，每盆4株。(2)用Levingtons M2培养土，并施用5g/L奥绿专用缓释肥（15:9:9+3MgO+TE；释放周期达5~6个月），并在介质表层铺一薄层蛭石。(3)用Teku植物支撑器（LBSHorticulture Colne Lancashire, UK)来支撑植株。(4)托盘中铺上Aquamat(LBSHorticulture)，每盘放6罐（底部宽30cm、长50cm的深砾石托盘）。(5)由Octamitters控制浇水。(6)所使用的生长箱是ConvironPGV/PGW36。2.小量甘油农杆菌制备法需要准备以下材料：(1)LB培养基（Sigma-Aldrich)(2)通用型试管（25mL，Sterilin)(3)85:15的LB培养基/甘油溶液（Sigma-Aldrich)3.农杆菌制备及接种需要准备以下材料：(1)YEP固体培养基：5g/L酵母提取物，10g/L蛋白胨，5g/LNaCl，15g/L琼脂，pH6.8（以上均购自Sigma-Aldrich)。(2)TSIM培养基：4.4g/LMS盐和维生素（MPBiomedicals),100mg/L肌醇，10g/L蔗糖，500mg/LMES缓冲液（以上均购自Sigma-Aldrich)，pH5.2，过滤除菌。(3)乙酰丁香酮（3,5-diphenoxy-4-hydroxyacetophenone) (Sigma-Aldrich)，0.1mol/L水溶液。(4)25μl至2.5mlHamilton可重复使用的注射分液器（图7.1)。 $\"\"$ (5)Hamilton注射器（50μl），带针头。(6)量筒（500ml)(7)玻璃棒或类似的支持物(8)透明塑料袋（455mmx600mm)(9)Sanyo多功能环境监测箱4.组织培养需要用到以下材料：(1)Domestos漂白剂（LeverBros)(2)乙醇溶液（70%V/V)：以去离子水配制(3)无菌去离子水(4)带15号刀片的手术刀（Swann-Morton，Sheffield，UK)(5)W4培养基：4.4g/LMS盐和维生素（MPBiomedicals),20g/L蔗糖（MerckKGaA，Germany)，2mg/L 2，4-D，钠盐（Sigma-Aldrich)，500mg/L谷氨酰胺（Sigma-Aldrich),100mg/L酪蛋白水解物（Sigma-Aldrich)，6g/L1-A型琼脂糖（Sigma-Aldrich)，150mg/L特美汀(ticarcillin disodium/potassium clavulanate) ( Melford Laboratories Ipswich, UK)，pH5.8。表7.1列出了培养基添加剂的制备细节。 $\"\"$ (6)W425G培养基：其余同W4培养基，额外加入25mg/LG418，重硫酸盐(Sigma-Aldrich)。 (7)MRM培养基：4.4g/LMS盐和维生素（MPBiomedicals),20g/L蔗糖（MerckKGaA, Germany)，6 g/L1-A型琼脂糖（Sigma-Aldrich)，2mg/L激动素(SigmaAldrich)，pH5.8。(8)MRM25G培养基：其余同MRM培养基，额外加入25mg/LG418，重硫酸盐(Sigma-Aldrich)。(9)Beatson广口瓶（250ml，Richardsons, Leicester,UK)以有盖培养皿的底作为盖子，并以25mm3M Micropore的胶带封口。(10)MS20培养基：4.4g/LMS盐和维生素（同前），20g/L蔗糖（Merck KGaA，Germany),7g/L经植物细胞培养测试过的琼脂（Sigma-Aldrich)，pH5.8。(11)Sanyo多功能环境监测箱。5.转基因幼苗的生长需要用到以下材料：(1)Jiffy7泥炭颗粒（Jiffy产品，Norway)(2)播种托盘及相应的24孔穴盘（可任选供应商）(3)适合播种盘大小的培养箱（可任选供应商）6.转基因植株的生长需要用到以下材料：(1)12F（直径12cm）盆钵，每盆种一株。(2)用LevingtonsM2的混合肥培养植株，并施以5g/L奥绿专用缓释肥（同前）(3)用Peasticks/splitcanes作为支撑物。(4)微孔面包袋（FocusPackaging)用于套袋。二、方法1.母株的生长(1)将种子播至施有缓释肥的M2混合肥中（同上），深度为2~3cm(每罐4颗）。(2)在盆的表层铺一薄层蛭石，以保持表层混合肥的质量。每罐放一个Teku植物支持器。(3)把盆栽放在Conviron生长箱里，培养条件是白天20℃、夜晚15℃，16h光周期，400μE/(m²·s)的光照（见注1)。2.收获(1)开花16~18天后收获分蘖，此时胚长至1mm大小。从植株基部剪掉分蘖（见注2)。(2)弃去底部的叶片，保留剑叶。(3)将分蘖立即放入装有水的500ml量筒中，修剪分蘖的长度以使剑叶正好位于量筒的顶部。3.脱粒(1)去除每穗底部2~3个小穗。(2)从下往上选取第一和第二朵花（图7.2)，小心地从花上去除颖片和外稃，仅使这两朵花的未成熟种子暴露出来。(3)剪去干扰接种的残余组织，即未动过的花（如第三、第四朵花等）的外稃/颖片及芒，切忌损伤裸露的种子，否则会导致共培养时真菌的污染。(4)用软刷向上刷穗以去除花药，否则也可能引起真菌生长。(5)用湿纸巾擦拭叶片。(6)轻轻地用70%（V/V）乙醇喷穗部，使其在接种前干燥（见注3)。4.制备农杆菌平板(1)制备少量含有质粒的甘油农杆菌。(2)从母板上挑取一个单克隆，在加有相应抗生素的LB培养基[16]里，28℃剧烈振荡培养过夜。取1ml到Eppendorf管中，10000g离心30s。去上清，并用1ml加有15%（m/V）甘油的LB重悬细胞。分装成小份，在-80°C保存。每次接种用一份新的甘油农杆菌，使用后弃之。(3)接种实验前，用保存的甘油农杆菌在含有相应抗生素的YEP平板上划线，使整块平板上长满菌斑。(4)封板，28℃培养1天，或者室温培养3天。 $\"\"$ 5.农杆菌重悬(1)用于接种的麦穗准备好之后，开始制备农杆菌的悬浮液。(2)用乙醇擦拭并烧灼一个平头铲，使之充分冷却下来。(3)用刮铲轻轻刮平板的表面来收集足量细菌，然后转移到含有10mlTSIM和400μmol/L乙酰丁香酮的25 mlUniversal管中。应避免带上平板上的胶，因为这会影响接种过程。(4)用1ml的Gilson移液枪反复吹打重悬细菌，直到变为均匀的悬浊液。6.接种(1)用70%（V/V）乙醇对注射器进行消毒处理4~5次，然后用无菌水冲洗4~5次。确保针孔朝向自己。(2)用注射器吸取农杆菌悬浮液。(3)手握住穗部，使针尖可以接触到种子的胚。把针放入穗部使针尖大约位于胚乳和盾片的接合部（图7.3)。盾片轻微的损伤不会产生影响，而且可作为正确接种的证据。(4)每次缓慢按下按钮注射1μl悬浮液。50μl的注射器，每按一次按钮注射1μl悬浮液。(5)对所有外露的种子重复这一过程。(6)在所有穗都接种后，在量筒中放一个支持物（如玻璃棒），然后用透明的塑料袋覆盖并在底部封口。让其在22°C、16h光周期、40μE/(m²·s)光照条件下生长2~3天（见注4)。(7)用70%（V/V）乙醇清洗注射器4~5次，用无菌水冲洗4~5次，再用70%乙醇洗一次，然后晾干。 $\"\"$ 7.隔离(1)接种2~3天后，将种子从穗上取下放入适合的有盖容器中。(2)对种子进行表面消毒：70%（V/V）乙醇1min，20%（V/V）Domestos漂白剂溶液25min，期间要搅拌。(3)在滤网中用无菌去离子水彻底清洗。(4)分离胚，然后放入W4培养基中，盾片向上，每皿放25个（见注5)。(5)用Parafilm膜密封平板，然后在28℃、16h光周期、80μE/(m²·s)光照条件下培养5天。8.组织培养(1)5天后，将胚轴从盾片上切除（见注6)，然后转移到新鲜的W4培养基上（见注7)。(2)培养12天后，将愈伤组织移到选择培养基上（W425G)。在25℃、16h光周期、80μE/(m²·s) 光照条件下培养2周（接下来的操作都在这一温度和光照条件下进行）。(3)选择2周后，将愈伤组织分成小块以便更好地接触到选择培养基，然后移到新鲜的W425G培养基上。(4)继续选择培养2周后，将有活力的胚性愈伤移到含有选择试剂的再生培养基上(MRM25G)。2周后再进行一次转移，将还未发育成芽的愈伤移到新的MRM25G培养基中。(5)将再生的芽移到含有MS20的Beatson罐，然后让其在25℃下培养（见注8)。(6)让芽生长大约1个月，在这期间叶和根应该发育完全。9.土壤移植和炼苗(1)用自来水湿润Jiffy7泥炭丸并放置于24孔穴盘中，将穴盘放到培植箱中。(2)从Beatson罐中把苗移出，避免根部带上琼脂。(3)将丛生的苗分开直至每一株苗只有一个芽。(4)将苗移到Jiffy7泥炭丸中，确保所有的根被Jiffy包埋，使得根能够接触到泥炭。去掉死的和将死的叶片。将生长中的叶片修整到5~10cm。在重新盖上培植箱盖前撒点水（见注9)。(5)在20℃生长2周后，如需要，植株可以用来做PCR检测和盆栽（见注10)。(6)为获得最大的产量，可将苗移到带M2培养土的12F罐中（见上），每罐一株苗。在将苗转移到土壤的过程中不要去除Jiffy泥炭丸外的网以保持泥炭丸的完整。(7)将开花的植株套袋以减少花粉的传播。

本文链接： http://mpbio.immuno-online.com/view-1533505600.html

发布于： 2026-03-21 阅读（）

没有了